| i）前処理 |
|
| 試料1) 1 ml（g） |
| ↓ |
i) 内部標準液2)20 μl，メダゼパム（あるいはジアゼパム）/メタノール溶液3)20 μlを加えて混和する．
ii) 2M 酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.5）4)50 μl，β-グルクロニダーゼ50 μlを加えて混和する．
iii) 56℃で2時間加温する． |
| 加水分解溶液 |
| ↓ |
i) 1M NaCO3緩衝液（pH 9.0）5)0.8 ml，メチル-tert-ブチルエーテル3 ml，クロロホルム1.5 mlを加える．
ii) 15分間 Vortexで撹拌後，1,000×gで3分間遠心する． |
| 有機層 |
| ↓ |
窒素気流下40℃で乾固する． |
| 残渣 |
| ↓ |
プロピル化
i) 2.5%TMAH（tetramethylammonium hydroxide）/メタノール溶液3 μlおよび
ヨウ化プロピル10 μlを含むアセトニトリル50 μlに溶解する．
ii) 1,000×gで3分遠心する． |
| 反応液 |
| ↓ |
i) ヘキサン/クロロホルム（3：１，v/v）2 ml， 0.1M NaHCO3緩衝液（pH 9.0）6)
0.15 mlを加えて混和する．
ii) Vortexで2分間撹拌する．
iii) 1,000×gで3分遠心する． |
| 有機層 |
| ↓ |
窒素気流下40℃で乾固する． |
| 残渣 |
| ↓ |
プロピオニル化
i) 塩化プロピオニル50 μlに溶解し，短時間Vortexで撹拌する．
ii) 無水K2CO3約0.3 mgを加えて混和する．
iii) 密栓し，65℃で10分加熱する． |
| 反応液 |
| ↓ |
過剰の塩化プロピオニルを窒素気流下，乾固する． |
| 残渣 |
| ↓ |
i) ヘキサン/クロロホルム（3：1，v/v） 1 ml，0.1M NaHCO3緩衝液（pH 9.0）6)0.1 mlを加えて混和する．
ii) Vortexで2分間撹拌する。
iii) 1,000×gで3分遠心後，有機層を窒素気流下，乾固する． |
| 残渣 |
| ↓ |
酢酸エチル25 μlに溶解し，1 μlを注入する． |
| GC/MS |
|
|
| 【注 解】 |
| １） |
試料は尿． |
| ２） |
各25 μg/mlのオキサゼパム-d5，ロラゼパム-d4，α-ヒドロキシアルプラゾラム-d5および α-ヒドロキシトリアゾラム-d4の混合メタノール溶液．重水素標識体が入手できないときは，内部標準物質を入れないで分析し，その試料に存在しないベンゾジアゼピンを内部標準物質にする． |
| ３） |
メダゼパム（あるいはジアゼパム）の1 mg/ml メタノール溶液は薬物の試験管への吸着による損失を防ぐために加える． |
| ４） |
氷酢酸57.2 mlを約350 mlの水で希釈し，pHメーターでモニターしながら，2M NaOH液 （80.0 g/l）でpH 4.5に調整後，水を加えて500
mlにする． |
| ５） |
NaHCO3 42 gを約430 mlの水に溶かし（やや溶けにくい)， pHメーターでモニターしながら，2M NaOH液（80.0 g/l）でpH 9.0に調整後，水を加えて500
mlにする． |
| ６） |
上記の1M 炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH 9.0）を水で10倍に希釈する． |
|
|
| ii）GC/MSの条件 |
|
|
| 装置： |
ガスクロマトグラフ/質量分析計 |
| カラム： |
retention gap カラム，5% phenylmethyl silicone，1 m×0.52 mm i.d.＋DB-1，15 m×0.25
mm i.d.，膜厚 0.25 μm |
| 温度： |
カラム 140℃（1 min）-（50℃/min）-220℃-（10℃/min）-290℃（0.5 min）
注入部 135℃（0.5 min）-（100℃/min）-285℃（8 min） |
| キャリアガス： |
ヘリウム 20 psi（線速度：45 cm/s） |
| イオン化： |
EI（電子衝撃），70 eV |
| 測定： |
質量範囲 m/z 210-450； 時間 約4.5（メダゼパムあるいはジアゼパム流出後）-10 min |
|
|
|
|
| 【注 解】 |
| １） |
ベンゾジアゼピンの保持時間を表４に示す． |
| ２） |
ベンゾジアゼピン系薬物の中で保持時間が長いトリアゾロベンゾジアゼピンおよび第2級アミン，ニトロ基，水酸基を持つ化合物の感度はそれ程高くない．個々の化合物に適った抽出法と機器分析条件の設定が必要である． |
|
| 表４．主なベンゾジアゼピン系薬物の保持時間 |
|
| 化 合 物 |
保持時間（分） |
|
| Medazepam |
3.67 |
| Diazepam |
4.50 |
N-Desalkylflurazepam
(N1-R2) |
4.78 |
| Chlordiazepoxide |
4.83 |
Nordiazepam
(N1-R2) |
4.88 |
Bromazepam
(N1-R2) |
5.27 |
| Flunitrazepam |
5.27 |
| Prazepam |
5.48 |
Norflunitrazepam
(N1-R2) |
5.85 |
| Nitrazepam |
6.00 |
| Flurazepam |
6.25 |
Oxazepam
(N1-R2, 3-O-R1) |
6.67 |
Clonazepam
(N1-R2) |
6.80 |
| Alprazolam |
7.17 |
Lorazepam
(N1-R2, 3-O-R1) |
7.38 |
| Triazolam |
7.70 |
N-Desethylflurazepam
(N-R1) |
8.10 |
α-Hydroxyalprazolam
(α-O-R1) |
8.72 |
α-Hydroxytriazolam
(α-O-R1) |
9.52 |
|
| R1：プロピル ； R2：プロピオニル |
|
|
|
| 【文 献】 |
| １） |
Meatherall R. J Anal Toxicol 1994；18：369-381． |
