i)前処理 |
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試料2) 2 ml(g) |
↓ |
i) 内部標準液3)20 μlおよびアセトン2 mlを加える.
ii) Vortexで撹拌後,2,000回転で5分遠心する. |
上清 |
↓ |
減圧で乾固する. |
残渣 |
↓ |
0.2M ホウ酸緩衝液4)(pH 9) 2 mlに溶解する. |
抽出カラム5) |
↓ |
i) 水1 mlおよび15% メタノール/水溶液1 mlで洗浄後,2,000回転5分間遠心する.
ii) メタノール1 mlで溶出する. |
溶出液 |
↓ |
窒素気流下50℃で乾固する. |
残渣 |
↓ |
メタノール20 μlに溶かし,その10 μlを注入する. |
HPLC |
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【注 解】 |
1) |
HPLC用の水は,使用前にフィルター(例えば,0.5 μm)を通した蒸留水,あるいはウルトラピュアー純水(例えば,ミリQ水)を使用する. |
2) |
血液あるいは血清. |
3) |
ブロチゾラムの25 μg/mlメタノール溶液. |
4) |
ほう酸12.4 gを700 mlの水に溶かし,pHメーターでモニターしながら,2M NaOH液(80 g/l)を加えてpH 9.0に調整後,水を加えて1,000
mlにする. |
5) |
Worldwide Monitoring Clean Up C18 end-capped extraction coulmn (Amchro, Sulzbach, Taunus).C18系のSep-Pak,Bond
Elutなどで代替可能. |
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ii)HPLCの条件 |
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装置:
検出器:
カラム:
カラム温度:
移動相:
流速:
測定: |
高速液体クロマトグラフ
ダイオードアレイ検出器(16 mm cell)
Kontrosorb RP 181), 25 cm×4.6 mm i.d.
室温
アセトニトリル 156 g/0.09M リン酸カリウム緩衝液(pH 2.3)2) 340 g
1.3 ml/min
波長 190-430 nm; 時間 25 min |
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【注 解】 |
1) |
C18 ODS系のHPLC用カラムで代替可能. |
2) |
リン酸(85%,特級)5.23 mlを約800 mlの水で希釈し,pHメーターでモニターしながら,1 M KOH液(56.1 g/l)でpH
2.3に調整後,水を加えて1,000 mlにする. |
3) |
ベンゾジアゼピンの保持時間を表1に示す. |
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表1.ベンゾジアゼピンの保持時間 |
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化 合 物 |
保持時間(分) |
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Chlordiazepoxide |
2.85 |
Oxazolam |
3.53 |
Midazolam |
3.99 |
Flurazepam |
4.04 |
Bromazepam |
4.23 |
Medazepam |
4.49 |
Oxazolam |
6.42 |
Nitrazepam |
6.43 |
Lorazepam |
6.90 |
Nordiazepam |
7.80 |
Estazolam |
7.85 |
Clonazepam |
7.96 |
Tetrazepam |
8.34 |
Temazepam |
10.01 |
Alprazolam |
10.29 |
Flunitrazepam |
10.41 |
Triazolam |
11.07 |
Brotizolam |
13.02 |
Diazepam |
14.94 |
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【文 献】 |
1. |
Mubhoff F, Daldrup T. Int J Leg Med 1992;105:105. |