| i）前処理 |
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| 試料2) 2 ml（g） |
| ↓ |
i) 内部標準液3)20 μlおよびアセトン2 mlを加える．
ii) Vortexで撹拌後，2,000回転で5分遠心する． |
| 上清 |
| ↓ |
減圧で乾固する． |
| 残渣 |
| ↓ |
0.2M ホウ酸緩衝液4)（pH 9） 2 mlに溶解する． |
| 抽出カラム5) |
| ↓ |
i) 水1 mlおよび15% メタノール/水溶液1 mlで洗浄後，2,000回転5分間遠心する．
ii) メタノール1 mlで溶出する． |
| 溶出液 |
| ↓ |
窒素気流下50℃で乾固する． |
| 残渣 |
| ↓ |
メタノール20 μlに溶かし，その10 μlを注入する． |
| HPLC |
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| 【注 解】 |
| １） |
HPLC用の水は，使用前にフィルター（例えば，0.5 μm）を通した蒸留水，あるいはウルトラピュアー純水（例えば，ミリＱ水）を使用する． |
| ２） |
血液あるいは血清． |
| ３） |
ブロチゾラムの25 μg/mlメタノール溶液． |
| ４） |
ほう酸12.4 gを700 mlの水に溶かし，pHメーターでモニターしながら，2M NaOH液（80 g/l）を加えてpH 9.0に調整後，水を加えて1,000
mlにする． |
| ５） |
Worldwide Monitoring Clean Up C18 end-capped extraction coulmn (Amchro, Sulzbach, Taunus)．C18系のSep-Pak，Bond
Elutなどで代替可能． |
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| ii）HPLCの条件 |
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装置：
検出器：
カラム：
カラム温度：
移動相：
流速：
測定： |
高速液体クロマトグラフ
ダイオードアレイ検出器（16 mm cell）
Kontrosorb RP 181), 25 cm×4.6 mm i.d.
室温
アセトニトリル 156 g/0.09M リン酸カリウム緩衝液（pH 2.3）2) 340 g
1.3 ml/min
波長 190-430 nm； 時間 25 min |
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| 【注 解】 |
| １） |
C18 ODS系のHPLC用カラムで代替可能． |
| ２） |
リン酸（85%，特級）5.23 mlを約800 mlの水で希釈し，pHメーターでモニターしながら，1 M KOH液（56.1 g/l）でpH
2.3に調整後，水を加えて1,000 mlにする． |
| ３） |
ベンゾジアゼピンの保持時間を表１に示す． |
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| 表1．ベンゾジアゼピンの保持時間 |
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| 化 合 物 |
保持時間（分） |
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| Chlordiazepoxide |
2.85 |
| Oxazolam |
3.53 |
| Midazolam |
3.99 |
| Flurazepam |
4.04 |
| Bromazepam |
4.23 |
| Medazepam |
4.49 |
| Oxazolam |
6.42 |
| Nitrazepam |
6.43 |
| Lorazepam |
6.90 |
| Nordiazepam |
7.80 |
| Estazolam |
7.85 |
| Clonazepam |
7.96 |
| Tetrazepam |
8.34 |
| Temazepam |
10.01 |
| Alprazolam |
10.29 |
| Flunitrazepam |
10.41 |
| Triazolam |
11.07 |
| Brotizolam |
13.02 |
| Diazepam |
14.94 |
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| 【文 献】 |
| １． |
Mubhoff F, Daldrup T. Int J Leg Med 1992；105：105. |
