| i）前処理 |
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| 試料1) 0.2 ml |
| ↓ |
i) 水1.3 ml，0.2 M 酢酸/酢酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）2) 1.0 mlおよび酢酸エチル/エーテル3)（1：1，v/v） 3 mlを加える．
ii) 2分間撹拌後，遠心分離（800 gで5分間）する． |
| 有機層 |
| ↓ |
スピッツ管に移し，窒素ガス気流で溶媒を留去する． |
| 残渣 |
| ↓ |
0.4 mM trimethylaniliumn hydroxide/メタノール溶液4)に溶かす． |
| GCあるいはGC/MS |
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| 【注 解】 |
| １） |
試料は血液，尿など．臓器はその２ｇに 0.05 N NaOH液 18 ml を加えて，ホモジナイズし，遠心分離 (12,000 g で20分間)
後，その上層のほぼ全量を分取し，エーテル 20 ml で２回洗浄する．水層を10% 酒石酸でpHを約6 に調整した後，酢酸エチル/エーテル (1：1,
v/v) 20 ml で２回抽出する．以下，液体試料と同様に操作する．但し，この方法は追試されていないので，回収率，夾雑ピークの有無等は不明である． |
| ２） |
酢酸ナトリウムの16.41 g/l 水溶液を調製し，0.１N 酢酸でpHを 6.0に調整する． |
| ３） |
抽出溶媒は，エーテル，酢酸エチル，クロロホルム，ジクロロメタンなども使用できるが，生体由来の夾雑ピークの少ない本抽出溶媒を採用した．なお，エーテル，酢酸エチル，ジクロロメタンはmetharbital
の抽出効率が低い (46-63%)． |
| ４） |
メチル化剤として 0.2 M trimethylaniliumn hydroxide (TMAH) (Pierce社製；Meth-EluteTM)
のメタノール溶液を使用する．TMAH/メタノール溶液の濃度は FID 検出器では 4 mM TMAH/メタノール溶液，NPD 検出器では 0.4
mM TMAH/メタノール溶液を用いる． |
| ５） |
検量線は各催眠薬の10 μg/ml メタノール溶液を用いて作成する．このメタノール溶液 (例えば 10，25，50，100，500，1000
μl) を取り，窒素ガスで溶媒を留去し，残渣に血清 0.2 ml を加えたものを用いる． |
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| ii）GCの条件 |
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装置：
検出器：
カラム：
温度：
キャリアガス： |
ガスクロマトグラフ
FID（水素炎イオン化検出器）
1% OV-17/Gas Chrom Q（AW-DMCS，80-100 mesh），
0.5 m×3 mm i.d.
カラム 140-（10℃/min）-220℃； 注入部・検出器 250℃
ヘリウム 50 ml/min |
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装置：
検出器：
カラム：
温度：
キャリアガス： |
ガスクロマトグラフ
NPD（窒素-リン検出器）
メチルシリコン系熔融シリカメガボアカラム，
15 m×0.53 mm i.d.， 膜厚 1 μm
カラム 60-（8℃/min）-250℃； 注入部・検出器 250℃
ヘリウム 30 ml/min 測定時間：約15分
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| iii）GC/MSの条件 |
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装置：
カラム：
温度：
キャリアガス：
イオン化：
測定： |
ガスクロマトグラフ/質量分析計
メチルシリコン系熔融シリカキャピラリーカラム，
15 m×0.25 mm i.d.， 膜厚 1 μm
カラム 60-（3 min，スプリットレス）-（8℃/min）-250℃；注入部 250℃； イオン源 250℃
ヘリウム 2 ml/min
CI（化学イオン化） 200 eV，EI（電子衝撃） 70 eV
質量範囲 m/z 50-600； 時間 約15分
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| 【注 解】 |
| １） |
TMAH によるオンカラムメチル化は，他のバルビツール酸系催眠薬 glutethimide, primidoneなどにも適応できるが，thiopentalはピークが出現せず不適である． |
| ２） |
FID 検出器では 1 - 5 mg/ml，NPD検出器では 1 - 5 μg/mlの濃度にする． |
| ３） |
バルビツール酸系催眠薬の ng オーダーの微量分析では，遊離塩基は OV-17 ではほとんどピークが検出されず，DB-1でも metharbital,
hexobarbital 以外は著しく感度が低い．一方，メチル誘導体は遊離塩基よりも感度が数倍から数十倍に上昇する．メチル誘導体の検出限界は，NPD検出器では
60-70 pg (DB-1) および約100-200 pg (OV-17)，FID検出器では 14-19 ng (DB-1) である．バルビツール酸系催眠薬の遊離塩基およびメチル誘導体の保持時間，保持指標を表１に，バルビツール酸系催眠薬のメチル誘導体のマススペクトルを表２に示す． |
| ４） |
試料注入部温度が低い (200℃以下) とオンカラムメチル化の効率が低下する． |
| ５） |
カラムはJ & W 社製の DB-1 またはその相当品が良い． |
| ６） |
検量線は 0.2-10 ng の範囲で良好な直線性が得られる．回収率は 0.1, 1.0, 5.0 μg 添加で 83-111%である． |
| ７） |
キャピラリーカラムを用いた催眠薬の分析は，機器製造会社のアプリケーションデータなどを参照． |
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| 表１．主なバルビツール酸系催眠薬の遊離塩基および誘導体の保持時間と保持指標 |
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| 化 合 物 |
保持時間（分） |
保持指標 |
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| 1% OV-17 |
DB-1 |
DB-1 |
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| Metharbital |
1.26 |
6.852 |
1407 |
| Methylmetharbital |
1.01 |
6.308 |
1367 |
| Allobarbital |
2.56 |
9.133 |
1569 |
| Methylallobarbital |
1.42 |
7.616 |
1457 |
| Amobarbital |
3.20 |
10.748 |
1688 |
| Methylamobarbital |
1.91 |
9.272 |
1575 |
| Pentobarbital |
3.70 |
10.976 |
1706 |
| Methylpentobarbital |
2.12 |
9.618 |
1600 |
| Secobarbital |
3.90 |
11.647 |
1758 |
| Methylsecobarbital |
2.40 |
10.183 |
1642 |
| hexobarbital |
4.90 |
12.342 |
1811 |
| Methylhexobarbital |
4.21 |
11.877 |
1772 |
| Phenobarbital |
6.16 |
13.506 |
1909 |
| Methylhenobarbital |
4.54 |
12.243 |
1801 |
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| 表２．主なバルビツール酸系催眠薬のメチル誘導体のマススペクトル |
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CI法（isobutane） |
EI法 |
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分子量 |
MH+ |
基準ピーク |
他のフラグメントイオン |
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| Methylmetharbital |
212 |
213 |
169 |
184，126，112 |
| Methylallobarbital |
236 |
237 |
195 |
138，194，110，221 |
| Methylamobarbital |
254 |
255 |
169 |
184，112，126 |
| Methylpentobarbital |
254 |
255 |
169 |
184，112，126 |
| Methylsecobarbital |
266 |
267 |
169 |
195，181，138，223 |
| Methylhexobarbital |
250 |
251 |
235 |
81，79，169 |
| Methylphenobarbital |
260 |
261 |
232 |
117，146，175，77 |
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| 【文 献】 |
| １． |
Tanaka E et al. Forensic Sci Int 1997；85：73-82. |
