i)前処理 |
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試料1) 0.2 ml |
↓ |
i) 水1.3 ml,0.2 M 酢酸/酢酸ナトリウム緩衝液(pH 6.0)2) 1.0 mlおよび酢酸エチル/エーテル3)(1:1,v/v) 3 mlを加える.
ii) 2分間撹拌後,遠心分離(800 gで5分間)する. |
有機層 |
↓ |
スピッツ管に移し,窒素ガス気流で溶媒を留去する. |
残渣 |
↓ |
0.4 mM trimethylaniliumn hydroxide/メタノール溶液4)に溶かす. |
GCあるいはGC/MS |
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【注 解】 |
1) |
試料は血液,尿など.臓器はその2gに 0.05 N NaOH液 18 ml を加えて,ホモジナイズし,遠心分離 (12,000 g で20分間)
後,その上層のほぼ全量を分取し,エーテル 20 ml で2回洗浄する.水層を10% 酒石酸でpHを約6 に調整した後,酢酸エチル/エーテル (1:1,
v/v) 20 ml で2回抽出する.以下,液体試料と同様に操作する.但し,この方法は追試されていないので,回収率,夾雑ピークの有無等は不明である. |
2) |
酢酸ナトリウムの16.41 g/l 水溶液を調製し,0.1N 酢酸でpHを 6.0に調整する. |
3) |
抽出溶媒は,エーテル,酢酸エチル,クロロホルム,ジクロロメタンなども使用できるが,生体由来の夾雑ピークの少ない本抽出溶媒を採用した.なお,エーテル,酢酸エチル,ジクロロメタンはmetharbital
の抽出効率が低い (46-63%). |
4) |
メチル化剤として 0.2 M trimethylaniliumn hydroxide (TMAH) (Pierce社製;Meth-EluteTM)
のメタノール溶液を使用する.TMAH/メタノール溶液の濃度は FID 検出器では 4 mM TMAH/メタノール溶液,NPD 検出器では 0.4
mM TMAH/メタノール溶液を用いる. |
5) |
検量線は各催眠薬の10 μg/ml メタノール溶液を用いて作成する.このメタノール溶液 (例えば 10,25,50,100,500,1000
μl) を取り,窒素ガスで溶媒を留去し,残渣に血清 0.2 ml を加えたものを用いる. |
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ii)GCの条件 |
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装置:
検出器:
カラム:
温度:
キャリアガス: |
ガスクロマトグラフ
FID(水素炎イオン化検出器)
1% OV-17/Gas Chrom Q(AW-DMCS,80-100 mesh),
0.5 m×3 mm i.d.
カラム 140-(10℃/min)-220℃; 注入部・検出器 250℃
ヘリウム 50 ml/min |
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装置:
検出器:
カラム:
温度:
キャリアガス: |
ガスクロマトグラフ
NPD(窒素-リン検出器)
メチルシリコン系熔融シリカメガボアカラム,
15 m×0.53 mm i.d., 膜厚 1 μm
カラム 60-(8℃/min)-250℃; 注入部・検出器 250℃
ヘリウム 30 ml/min 測定時間:約15分
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iii)GC/MSの条件 |
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装置:
カラム:
温度:
キャリアガス:
イオン化:
測定: |
ガスクロマトグラフ/質量分析計
メチルシリコン系熔融シリカキャピラリーカラム,
15 m×0.25 mm i.d., 膜厚 1 μm
カラム 60-(3 min,スプリットレス)-(8℃/min)-250℃;注入部 250℃; イオン源 250℃
ヘリウム 2 ml/min
CI(化学イオン化) 200 eV,EI(電子衝撃) 70 eV
質量範囲 m/z 50-600; 時間 約15分
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【注 解】 |
1) |
TMAH によるオンカラムメチル化は,他のバルビツール酸系催眠薬 glutethimide, primidoneなどにも適応できるが,thiopentalはピークが出現せず不適である. |
2) |
FID 検出器では 1 - 5 mg/ml,NPD検出器では 1 - 5 μg/mlの濃度にする. |
3) |
バルビツール酸系催眠薬の ng オーダーの微量分析では,遊離塩基は OV-17 ではほとんどピークが検出されず,DB-1でも metharbital,
hexobarbital 以外は著しく感度が低い.一方,メチル誘導体は遊離塩基よりも感度が数倍から数十倍に上昇する.メチル誘導体の検出限界は,NPD検出器では
60-70 pg (DB-1) および約100-200 pg (OV-17),FID検出器では 14-19 ng (DB-1) である.バルビツール酸系催眠薬の遊離塩基およびメチル誘導体の保持時間,保持指標を表1に,バルビツール酸系催眠薬のメチル誘導体のマススペクトルを表2に示す. |
4) |
試料注入部温度が低い (200℃以下) とオンカラムメチル化の効率が低下する. |
5) |
カラムはJ & W 社製の DB-1 またはその相当品が良い. |
6) |
検量線は 0.2-10 ng の範囲で良好な直線性が得られる.回収率は 0.1, 1.0, 5.0 μg 添加で 83-111%である. |
7) |
キャピラリーカラムを用いた催眠薬の分析は,機器製造会社のアプリケーションデータなどを参照. |
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表1.主なバルビツール酸系催眠薬の遊離塩基および誘導体の保持時間と保持指標 |
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化 合 物 |
保持時間(分) |
保持指標 |
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1% OV-17 |
DB-1 |
DB-1 |
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Metharbital |
1.26 |
6.852 |
1407 |
Methylmetharbital |
1.01 |
6.308 |
1367 |
Allobarbital |
2.56 |
9.133 |
1569 |
Methylallobarbital |
1.42 |
7.616 |
1457 |
Amobarbital |
3.20 |
10.748 |
1688 |
Methylamobarbital |
1.91 |
9.272 |
1575 |
Pentobarbital |
3.70 |
10.976 |
1706 |
Methylpentobarbital |
2.12 |
9.618 |
1600 |
Secobarbital |
3.90 |
11.647 |
1758 |
Methylsecobarbital |
2.40 |
10.183 |
1642 |
hexobarbital |
4.90 |
12.342 |
1811 |
Methylhexobarbital |
4.21 |
11.877 |
1772 |
Phenobarbital |
6.16 |
13.506 |
1909 |
Methylhenobarbital |
4.54 |
12.243 |
1801 |
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表2.主なバルビツール酸系催眠薬のメチル誘導体のマススペクトル |
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CI法(isobutane) |
EI法 |
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分子量 |
MH+ |
基準ピーク |
他のフラグメントイオン |
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Methylmetharbital |
212 |
213 |
169 |
184,126,112 |
Methylallobarbital |
236 |
237 |
195 |
138,194,110,221 |
Methylamobarbital |
254 |
255 |
169 |
184,112,126 |
Methylpentobarbital |
254 |
255 |
169 |
184,112,126 |
Methylsecobarbital |
266 |
267 |
169 |
195,181,138,223 |
Methylhexobarbital |
250 |
251 |
235 |
81,79,169 |
Methylphenobarbital |
260 |
261 |
232 |
117,146,175,77 |
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【文 献】 |
1. |
Tanaka E et al. Forensic Sci Int 1997;85:73-82. |