i)前処理 |
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試料1) 0.5 ml |
↓ |
i) 内部標準液2) 50 μl,水 0.5 ml,0.2M 酢酸/酢酸ナトリウム緩衝液
(pH 6.0)3) 0.1 mlおよび酢酸エチル/エーテル(1:1,v/v) 3 mlを加える.
ii) 2分間撹拌後,遠心分離(800 gで5分間)する. |
有機層 |
↓ |
スピッツ管に移し,窒素ガス気流で溶媒を留去する. |
残渣 |
↓ |
移動相100 μlを加えて溶かし,その10 μlを注入する. |
HPLC |
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【注 解】 |
1) |
試料は血液,尿など.臓器は,細切りした組織 1 gに水 4 ml を加え,ホモジナイズし,遠心分離 (12,000 g で10分間) し,上清
1 ml を取り,液体試料の測定法と同様に操作する. |
2) |
内部標準液は 5-(4-メチルフェニル)-5-フェニルヒダントインをメタノールに溶かし,10 μg/ml の溶液とする. |
3) |
酢酸ナトリウムの16.41 g/l 水溶液を調製し,0.1N 酢酸でpHを 6.0に調整する. |
4) |
検量線は各催眠薬をメタノールに溶かし,10 μg/ml の濃度にする.このメタノール溶液(例えば 10,25,50,100,500,1000
μl)を取り,窒素ガスで溶媒を留去し,残渣に血清 0.5 ml を加えたものを用いる. |
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ii)HPLCの条件 |
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装置:
検出器:
カラム:
カラム温度:
移動相:
流速:
測定: |
高速液体クロマトグラフ
紫外可視検出器
ODS-80Ts1), 10 cm×4.6 mm i.d. 粒径 2 μm2)
室温
アセトニトリル/8 mM リン酸(3:7, v/v)3)
0.4 ml/min
波長 215 nm; 時間 25 min |
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【注 解】 |
1) |
カラムはZorbax ODS,Hypersil ODSなどのODS (オクタデシルシラン系シリカゲル) 同等品で代替できるが,保持時間が異なってくる. |
2) |
粒径5 μmの充填剤が一般によく用いられるが,この場合は保持時間が長くなるので注意. |
3) |
KH2PO4(リン酸二水素カリウム,99%)770 mgを700 mlの水に溶かした後,アセトニトリル300 mlを加えて1,000 mlにする. |
4) |
試験液10 μl を高速液体クロマトグラフに注入し,得られたクロマトグラムを標準液のそれと比較し,標準液から作成した検量線によって定量を行う.定量範囲は
0.1-5 μg/ml である. |
5) |
催眠薬の保持時間および検出限界を表1に示す.また,血液からの回収率はすべて95-104 % の範囲にある.本法による尿分析では,保持時間10分位までは尿成分の妨害ピークが出現するので,保持時間の短い薬物は分析できないことがある.定量範囲は0.1–5
μg/mlである. |
6) |
本法ではpentobarbital,hexobarbital,amobarbitalのピークはほぼ重なるので注意. |
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表1.主なバルビツール酸系催眠薬の保持時間および検出限界 |
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化合物 |
保持時間(分) |
検出限界(μg/ml) |
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Barbital |
3.8 |
0.05 |
Allobarbital |
5.1 |
0.05 |
Metharbital |
5.9 |
0.05 |
Phenobarbital |
6.1 |
0.05 |
Pentobarbital |
7.1 |
0.05 |
Cyclobarbital |
10.6 |
0.05 |
Hexobarbital |
10.6 |
0.05 |
Amobarbital |
10.9 |
0.05 |
Secobarbital |
14.2 |
0.05 |
Thiopental |
21.8 |
0.5 |
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【文 献】 |
1. |
Tanaka E et al. Forensic Sci Int 1997;85:73-82. |