| i）前処理 |
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| 試料1) 0.5 ml |
| ↓ |
i) 内部標準液2) 50 μl，水 0.5 ml，0.2M 酢酸/酢酸ナトリウム緩衝液
（pH 6.0）3) 0.1 mlおよび酢酸エチル/エーテル（1：1，v/v） 3 mlを加える．
ii) 2分間撹拌後，遠心分離（800 gで5分間）する． |
| 有機層 |
| ↓ |
スピッツ管に移し，窒素ガス気流で溶媒を留去する． |
| 残渣 |
| ↓ |
移動相100 μlを加えて溶かし，その10 μlを注入する． |
| HPLC |
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| 【注 解】 |
| １） |
試料は血液，尿など．臓器は，細切りした組織 1 gに水 4 ml を加え，ホモジナイズし，遠心分離 (12,000 g で10分間) し，上清
1 ml を取り，液体試料の測定法と同様に操作する． |
| ２） |
内部標準液は 5-(4-メチルフェニル)-5-フェニルヒダントインをメタノールに溶かし，10 μg/ml の溶液とする． |
| ３） |
酢酸ナトリウムの16.41 g/l 水溶液を調製し，0.１N 酢酸でpHを 6.0に調整する． |
| ４） |
検量線は各催眠薬をメタノールに溶かし，10 μg/ml の濃度にする．このメタノール溶液（例えば 10，25，50，100，500，1000
μl）を取り，窒素ガスで溶媒を留去し，残渣に血清 0.5 ml を加えたものを用いる． |
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| ii）HPLCの条件 |
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装置：
検出器：
カラム：
カラム温度：
移動相：
流速：
測定： |
高速液体クロマトグラフ
紫外可視検出器
ODS-80Ts1), 10 cm×4.6 mm i.d. 粒径 2 μm2)
室温
アセトニトリル/8 mM リン酸（3：7, v/v）3)
0.4 ml/min
波長 215 nm； 時間 25 min |
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| 【注 解】 |
| １） |
カラムはZorbax ODS，Hypersil ODSなどのODS (オクタデシルシラン系シリカゲル) 同等品で代替できるが，保持時間が異なってくる． |
| ２） |
粒径5 μmの充填剤が一般によく用いられるが，この場合は保持時間が長くなるので注意． |
| ３） |
KH2PO4（リン酸二水素カリウム，99%）770 mgを700 mlの水に溶かした後，アセトニトリル300 mlを加えて1,000 mlにする． |
| ４） |
試験液10 μl を高速液体クロマトグラフに注入し，得られたクロマトグラムを標準液のそれと比較し，標準液から作成した検量線によって定量を行う．定量範囲は
0.1-5 μg/ml である． |
| ５） |
催眠薬の保持時間および検出限界を表１に示す．また，血液からの回収率はすべて95-104 % の範囲にある．本法による尿分析では，保持時間10分位までは尿成分の妨害ピークが出現するので，保持時間の短い薬物は分析できないことがある．定量範囲は0.1–5
μg/mlである． |
| ６） |
本法ではpentobarbital，hexobarbital，amobarbitalのピークはほぼ重なるので注意． |
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| 表1．主なバルビツール酸系催眠薬の保持時間および検出限界 |
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| 化合物 |
保持時間（分） |
検出限界（μg/ml） |
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| Barbital |
3.8 |
0.05 |
| Allobarbital |
5.1 |
0.05 |
| Metharbital |
5.9 |
0.05 |
| Phenobarbital |
6.1 |
0.05 |
| Pentobarbital |
7.1 |
0.05 |
| Cyclobarbital |
10.6 |
0.05 |
| Hexobarbital |
10.6 |
0.05 |
| Amobarbital |
10.9 |
0.05 |
| Secobarbital |
14.2 |
0.05 |
| Thiopental |
21.8 |
0.5 |
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| 【文 献】 |
| １． |
Tanaka E et al. Forensic Sci Int 1997；85：73-82. |
