i)前処理 |
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試料1) 0.5 ml |
↓ |
i) 1N HCl 0.2 ml,内部標準液2)10 μl およびジクロロメタン3 mlを加える.
ii) 2分間撹拌後,遠心分離(800 gで5分間)する. |
有機層 |
↓ |
スピッツ管に移し,窒素ガス気流で溶媒を留去する. |
残渣 |
↓ |
移動相100 μl(HPLC)あるいは酢酸エチル100 μlに溶かす3). |
HPLC あるいは GC |
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【注 解】 |
1) |
試料は血清,尿など.尿試料の分析では,尿成分のピークの妨害を受けるので,同定には注意すること.尚,全血の分析では下記の論文に記載されているExtrelutやSep-Pak
C18カートリッジカラムによる前処理法が良い. |
2) |
内部標準液はフェニトインの500 μg/mlメタノール溶液を使用する. |
3) |
HPLCには10-50 μlを,GCには1-2 μlを注入する. |
4) |
検量線はブロムワレリル尿素の10 μg/mlメタノール溶液を用いて作成する.このメタノール溶液 (例えば 10,25,50,100,500,1000
μl) を取り,窒素ガス気流 (室温) で溶媒を留去し,残渣に血清 0.5 ml を加えたものを用いる. |
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ii)HPLCの条件 |
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装置:
検出器:
カラム:
カラム温度:
移動相:
流速:
測定: |
高速液体クロマトグラフ
紫外可視検出器
ODS-80Ts1), 10 cm×4.6 mm i.d. ;粒径 5 μm2)
室温
アセトニトリル/8 mM KH2PO4液(35:65, v/v)3)
0.7 ml/min
波長 225 nm; 時間 15 min |
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【注 解】 |
1) |
カラムはZorbax ODS,Hypersil ODSなどのODS (オクタデシルシラン系シリカゲル) 同等品で代替できるが,保持時間が異なってくる. |
2) |
本法によるブロムワレリル尿素の定量範囲は 0.05-5 μg/ml である.ブロムワレリル尿素および内部標準物質の保持時間はそれぞれ約 7.2分および約12.4分である. |
3) |
KH2PO4(リン酸二水素カリウム,99%)770 mgを650 mlの水に溶かした後,アセトニトリル350 mlを加えて1,000 mlにする. |
4) |
ブロムワレリル尿素による中毒死の血中レベルについて,菱田らは 44.0-93.8 μg/ml,真口らは67-134 μg/ml,寺田らは他剤と併用
37 μg/ml,松原らは他剤と併用 23.6 μg/ml,屋敷らは他剤と併用 31.5 μg/ml,40.8 μg/ml;単剤114 μg/ml
と報告している. |
5) |
試験液 10 μl をHPLCに注入し,得られたクロマトグラムを標準液のそれと比較し,標準液から作成した検量線によって定量を行う. |
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【文 献】 |
1. |
松原和夫 他.衛生化学 1986;32:368-372. |
2. |
Miyauchi H et al. J Anal Toxicol 1991;15:123-125. |
3. |
菱田 繁.日法医誌 1968;22:577 |
4. |
真口孝順.北海道医誌 1961;36:559. |
5. |
小嶋 亨 他.日法医誌 1976;30:365-367. |
6. |
屋敷幹雄 他.日法医誌 1987;41:452-456. |